據(jù)估計，僅在美國每年就有大約10000名兒童接受性腺毒性癌癥治療，存活的兒童會遭受化療和放療，化療后常見的不良反應(yīng)包括少精子癥和無精子癥，這會導(dǎo)致暫時或永久性男性不育。

目前臨床批準(zhǔn)的保留青少年和成人生育能力的選擇是冷凍保存精子，但精子保存不適用于青春期前的男孩，因?yàn)榫影l(fā)生尚未開始。細(xì)胞毒性化療藥物不僅對有絲分裂活躍的細(xì)胞產(chǎn)生有害影響，還會破壞精子發(fā)生和細(xì)胞凋亡過程之間的調(diào)節(jié)平衡，導(dǎo)致性腺毒性。

近日，芝加哥大學(xué)F.L.A等在《INT J MOL SCI 》一項(xiàng)研究中，研究人員通過睪丸內(nèi)（IT）注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療青春期前化療誘導(dǎo)的睪丸損傷小鼠模型，分析了單次與多次IT注射外泌體對睪丸功能和生育能力的影響，并評估IT注射是否為精子發(fā)生提供了長期保護(hù)作用。

一、外泌體對人支持細(xì)胞的影響

為了評估外泌體對體外暴露于多化療的人支持細(xì)胞的保護(hù)作用，研究人員使用人支持細(xì)胞的睪丸毒性(TT)模型，并用1.5 109外泌體顆粒預(yù)處理生育保護(hù)(FP)組24h。

與CTX組相比，F(xiàn)P組顯示出更好的細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力（圖1a）；在測試候選基因中，與CTX組相比，F(xiàn)P組PCNA、Ki67、Bcl-2、RAD51和SSC標(biāo)記hGDNF、BMP4和IGF-1的相對基因表達(dá)顯著上調(diào)，同時下調(diào)CASP3，這表明外泌體具有促細(xì)胞增殖、抗凋亡和DNA修復(fù)機(jī)制（圖1b）。

二、外泌體改善化療后的睪丸大小和睪丸重量

研究人員通過培育成功開發(fā)出了青春期前雄性小鼠群體，將雄性幼崽分為對照、CTX、外泌體單次注射(ES+CTX)和Exo-多次注射(EM+CTX)，4周齡時，外泌體組在CTX腹腔注射前24小時，通過睪丸內(nèi)注射1.5*109顆粒/mL 10μL外泌體。

我們比較了四組之間的睪丸重量和大小。與對照組相比，CTX組的睪丸重量和大小減少了約50%；外泌體組移植后4周，參數(shù)顯著增強(qiáng)，接近正常水平(圖2c、d)。與對照組和外泌體組相比，CTX組的睪丸宏觀外觀明顯更?。▓D2e）。

三、外泌體在化療期間保護(hù)睪丸并保留生育能力

通過繁殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，CTX組沒有小鼠受孕，外泌體組受孕率和平均幼崽數(shù)量均有增加；健康對照組和EM+CTX組的妊娠率相似（75%），其次是ES+CTX組（62.5%,圖3a）。與ES+CTX組相比，EM+CTX組的幼崽平均數(shù)和總數(shù)均顯著較高（圖3b）。

睪丸組織學(xué)顯示，化療破壞了CTX組的生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，而外泌體組保留了睪丸形態(tài)、間質(zhì)細(xì)胞和生精小管形態(tài)。血清激素分析顯示化療對間質(zhì)細(xì)胞造成永久性損傷，睪酮分泌顯著減少，外泌體組表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞損傷減少，睪酮的產(chǎn)生在8周時恢復(fù)（圖3d）。

四、外泌體保護(hù)生育力、增強(qiáng)精子發(fā)生相關(guān)基因標(biāo)記并調(diào)節(jié)相關(guān)途徑

為了探討外泌體恢復(fù)生精功能的潛在程度，我們分析了在生精中起關(guān)鍵作用的生殖細(xì)胞特異性(GCS)候選基因在小鼠睪丸組織中的mRNA表達(dá)。

在測試的基因中，與ES+CTX和CTX組相比，EM+CTX組中的CDK-10、CREM、Mea1、Pou5f1 和ZBTB16顯著上調(diào)（圖4c）。在成熟精母細(xì)胞核中強(qiáng)烈表達(dá)的SYCP3和抗凋亡標(biāo)記物Bcl-2僅在ES+CTX組中顯著上調(diào)（圖4d）。精子發(fā)生的中心標(biāo)記基因，如FSHR和C-Kit，被發(fā)現(xiàn)在 EM+CTX組中表達(dá)更多（圖4d）。

為了分析保護(hù)作用背后可能的分子機(jī)制，我們評估了幾種信號通路蛋白的磷酸化水平。 Western blot結(jié)果顯示，外泌體可能抑制p38 MAPK/ERK信號通路，從而提高生殖細(xì)胞化療耐受性（圖4e）。 

五、外泌體有助于永久恢復(fù)生育能力

為了評估外泌體是否有助于永久恢復(fù)化療后的生育能力，研究人員做了多次繁殖實(shí)驗(yàn)。分析第三次繁殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTX組中有八分之一的小鼠懷孕，而其它組的懷孕率與第一和第二次繁殖周期相似（圖5a），即對照組（100%）、EM+CTX（75%）、ES+CTX (62.5%)，這表明外泌體可能有助于永久恢復(fù)化療后的生育能力。

總 結(jié)：研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體能通過保留SSC生態(tài)位和防止小鼠睪丸損傷，從而發(fā)揮保護(hù)生育能力的作用，而接受多次注射外泌體的小鼠表現(xiàn)出顯著更高的生育率和血清睪酮水平，這表明外泌體療法可能是青春期前男孩化療治療的一種新型生育保護(hù)方法。

參考資料：

Farzana Liakath Ali, Hang-Soo Park, Analea Beckman, Adrian C. Eddy, Samar Alkhrait,Mohammad Mousaei Ghasroldasht, Ayman Al-Hendy and Omer Raheem. Fertility Protection, A Novel Concept: Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Protect against Chemotherapy-Induced Testicular Cytotoxicity. DOI:10.3390/ijms25010060.